Semaine 8 : Hantise du brocoli ; caprice d'enfant ou excuse génétique?

Lors de cette séance, nous avons enfin pu comprendre pourquoi certaines personnes ne supportent pas le brocoli, en étudiant leur ADN, ce qui permettait de connaître leurs génotype, puis leur phénotype, et donc d connaître leur degré de sensibilité à l'amertume.

Plusieurs étapes sont nécessaires pour répondre à cette question.

La première étape est celle de l'extraction de l'ADN

Après avoir réalisé quelques essais pour maîtriser le prélèvement de la micropipette, nous avons pu extraire notre ADN:

- Préparation du tube:

Dans un tube de 200 µL mettre 50 µL de X-tract Buffer et y déposer des cellules de la personne testée à l'aide d'un cure-dent, frotté contre sa joue.

Incuber le tube à 95°C pendant 10 minutes.

Explication des réactifs et de la température

Le X-tract Buffer sert à affaiblir les membranes nucléaires et cytoplasmiques, qui vont ensuite disparaître grâce à la MiniPCR, chauffant les tubes à PCR à 95°C. Ayant pour résultat l'extraction de l'ADN.

Une fois l'ADN extrait il faut passer à la préparation de la PCR.

Disposer 12 µL PTC Primer Mix (amorces) et 12 µL de EZ PCR Master Mix (nucléotides libres et Taq polymérase) dans un second tube de 200 µL. Y ajouter 3 µL de la première préparation.

Si besoin, placer les tubes dans une centrifugeuse pour retirer les éventuelles bulles

La PCR

Explication de la PCR à travers trois schémas représentant ses différentes étapes:

Cette première étape se fait à 94°C pendant 10 secondes

La deuxième se fait à 58°C pendant 15 secondes

La troisième se fait à 72°C pendant 40 secondes

Le cycle est ensuite répété trente fois afin de réaliser la PCR

Voici la machine que nous avons utilisée :

Digestion de l'ADN

explication des réactifs et de la température:

Lors de l'étape de la digestion de l'ADN par les enzymes de restriction, on verse 14ul d'ADN de la parer 1ul d'enzyme de restriction, ici l'enzyme Fnu4HI, dans un tube. On choisit cette enzyme car elle coupe la séquence ADN en un site précis appelé site de restriction (GCNGC). Or l'allèle sensible présente une mutation en 785 qui correspond au site de restriction de l'enzyme Fnu4HI. Ainsi, après avoir verser ces enzymes dans le tube, la séquence ADN d'un individu sera coupée en plusieurs partie ou non, selon les allèles qu'elle possède. Cette enzyme est donc utilisée car elle permet de distinguer l'allèle sensible du non sensible.

De plus on fait chauffer le tube contenant l'enzyme Fnu4HI 15 min à 37°C. Cela correspond en effet à la "température d'incubation" de l'enzyme; c'est à dire la température à laquelle l'enzyme fonctionnera correctement.

Schéma de la première étape de la digestion de l'ADN par l'enzyme de restriction Fnu4HI

Schéma de la deuxième étape de la digestion de l'ADN par l'enzyme de restriction Fnu4HI

Schéma de la troisième étape de la digestion de l'ADN par l'enzyme de restriction Fnu4HI

Schéma de la quatrième étape de la digestion de l'ADN par l'enzyme de restriction Fnu4HI

L'électrophorèse

L'enzyme découpe le gène correspondant à la sensibilité au PTC à la position 785, position d'une mutation par substitution d'une cytosine en thymine pour l'allèle sensible, créant ainsi un site de restriction pour Fnu4HI, lui permettant de pouvoir découpera séquence ADN d'un individu lorsqu'il possède au moins un allèle sensible.

Dans le puis dit "étalon" (situé à gauche de la photographie), qui permet de mesurer la distance parcourue par l'ADN dans les autres puits, il y a 5 fragments de restriction distincts de 100pb, 200pb, 300pb, 400pb, et 500pb. Or nous avions observé grâce à une simulation de l'électrophorèse,que plus un fragment d'ADN est petit, plus la distance qu'il parcours est élevée. Ainsi, on en déduit que dans le puit 1 le fragment d'ADN le plus loin est de 100pb, le deuxième de 200pb, le troisième de 300pb, le quatrième de 400pb et le cinquième de 500pb. 

Sur cette photographie, on observe que:

- dans les puit 1 et 4, la personne possède 3 fragments d'ADN distincts, issus donc, d'un même fragment découpé deux fois par l'enzyme de restriction. Lorsque l'on se réfère à l'étalon, ils ont une taille, de haut en bas, de 250 bp, 150 bp et 100bp.

Or on sait que l'allèle non sensible, ou non taster mesure 250 bp, et le sensible, ou taster, est divisé en deux parties mesurant l'une 150 bp et l'autre 100. De plus, une personne possédant deux allèles identiques pour un même gène est appelée homozygote. Lorsqu'elle possède deux allèle différents, elle est appelée hétérozygote.

Donc on peut en déduire que les personnes à qui l'ADN des puits 2 et 4 appartient possèdent un allèle sensible et un non sensible. Elles possèdent donc deux allèle différent d'un même gène, celui de la sensibilité au PTC et sont hétérozygotes.

Donc le génotype de ces deux individus est : (sensible//non sensible) et leur phénotype :

[sensible]. Cette personne est donc modérément sensible au PTC, donc à l'amertume: lors du test PTC, elle a du sentir l'amertume et donc réussir à distinguer les deux bandelettes (celle contenant du PTC de celle n'en contenant pas).

- Dans le puit 2, la personne possède un seul fragment d'ADN, mesurant, d'après l'étalon, 250 bp.

Or, après digestion de l'ADN par les enzymes de restriction, l'allèle non sensible mesure 250 bp.

On peut donc en déduire que la personne a qui appartient l'ADN du puit 3 possède donc deux allèles non sensibles, et est donc homozygote.

Son génotype est donc: (non sensible//non sensible) et son phénotype : [non sensible]. Cette personne est donc complètement insensible au PTC, donc à l'amertume: lors du test PTC, elle na du sentir l'amertume, et ainsi n'a pas pu distinguer les deux bandelettes.

-Dans le puis 3, on voit que la personne possède deux fragments d'ADN mesurant, d'après l'étalon, 150 et 100 bp.

Or, ces mesures correspondent à celle d'un allèle sensible après digestion de l'ADN par l'enzyme de restriction.

Donc on peut en déduire que cette personne possède deux allèles sensible au PTC; elle est donc homozygote.

Son génotype est : (sensible//sensible) et son phénotype [sensible].ette personne est donc très sensible au PTC, donc à l'amertume: lors du test PTC, elle a du sentir l'amertume et reconnaître instantanément la bandelette contenant du PTC de celle n'en contenant pas.

En conclusion, il suffit qu'un individu possède au moins un allèle sensible ou taste pour le rendre sensible au PTC donc à l'amertume, augmentant ainsi ses chances de ne pas aimer le brocoli, qui en contient.